牛傳染性胸膜肺炎檢測試劑盒（實時熒光PCR法）說明書
【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：牛傳染性胸膜肺炎檢測試劑盒（實時熒光PCR法）
英文名稱：Contagious Bovine Pleuropneumonia (CBPP)Detecting Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】 25T/盒 ＆ 50T/盒
【預期用途】
本試劑盒利用改良分子信標實時熒光PCR原理，主要用于牛傳染性胸膜肺炎的定性篩查檢測。
【檢驗原理】
本試劑盒針對牛傳染性胸膜肺炎基因設計特異性引物和探針，在反應體系中含有牛傳染性胸膜肺炎 DNA模板的情況下，PCR反應得以進行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR過程中相應通道的信號強度進行實時監(jiān)測和輸出，實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。
【主要組成成份】
序號 | 組成 | 25T/盒 | 50T/盒 |
1 | 牛傳染性胸膜肺炎 PCR反應液 | 437.5μL×1管 | 875μL×1管 |
2 | 牛傳染性胸膜肺炎 混合酶液 | 62.5μL×1管 | 125μL×1管 |
3 | 牛傳染性胸膜肺炎 陽性對照 | 40μL×1管 | 40 μL×1管 |
4 | 牛傳染性胸膜肺炎 陰性對照 | 40μL×1管 | 40 μL×1管 |
5 | DNA提取液 | 1.5 mL×1管 | 1.5 mL×2管 |
6 | 說明書 | 1份 | 1份 |
注：陰性對照為不含牛傳染性胸膜肺炎核酸的其它菌的混合物，陽性對照為牛傳染性胸膜肺炎經(jīng)滅活處理的核酸提取物。
【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復凍融，有效期12個月。
【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、等多通道實時熒光定量PCR儀。
【樣本要求】
1. 動物組織樣本采集后取10mg～100mg用滅菌生理鹽500μL～1000μL水研磨，離心后取上懸液備用，避免標本間交叉污染。
2. 標本收集后若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存，標本應凍存于-20℃～-80℃，長期保存不會影響本試劑盒檢測結(jié)果，但有可能影響培養(yǎng)法檢測結(jié)果的準確性。
3. 標本保存期間應避免反復凍融。
【檢驗方法】
1. 試劑準備（試劑準備區(qū)）
（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑，充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。
（2）核算當次實驗所需要的反應數(shù)（n），并根據(jù)如下表所示反應體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。
n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預留量（1T）+樣本數(shù)
單反液配制表(每頭份) | PCR反應液 | 17.5 μL |
混合酶液（Taq酶+UNG酶） | 2.5 μL |
(3)在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管。
(4) 蓋緊PCR反應管蓋后將PCR反應管和試劑盒中的DNA提取液轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。 剩余試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存。
2.樣本準備（樣本處理區(qū)）
用本公司病毒核酸提取試劑盒提取DNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作。或按以下方法操作：
a.取試劑準備區(qū)傳遞過來的DNA提取液，2000 rpm 離心10 s后備用。
b.取樣本自然沉降后的上清液1 mL，加入到1.5 mL無菌離心管中，12000 rpm離心5 min后，吸干上清，保留沉淀。
c.每管沉淀中加入DNA提取液50 μL，將沉淀懸浮后100℃加熱處理5 min。
d.12000 rpm離心2 min，取上清用于PCR檢測。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應樣本管中分別加入處理好的待測標本DNA各5μl、終體積25μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體積為25μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。
4.PCR（PCR擴增區(qū)）
（1）取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應管，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應位置，并記錄放置順序。
（2）按下表設置儀器核酸擴增相關參數(shù)進行PCR擴增。
反應體積 | 25 μL | 通道選擇 | FAM通道采集牛傳染性胸膜肺炎 熒光信號 |
PCR 反應 條件 | 步驟 | 條件 | 循環(huán)數(shù) |
UNG處理 | 50℃：2分鐘（min） | 1 | |
預變性 | 95℃：3分鐘（min） | 1 | |
預擴增 | 95℃：5秒（s） | 5 | |
55℃：40秒（s） | |||
PCR擴增 | 95℃：5秒（s） | 40 | |
55℃：40秒（s） （此階段結(jié)束時采集熒光信號） |
注：ABI系列熒光PCR儀在設置時不選ROX校正，設置淬滅基團選擇None。
【陽性判斷值或者參考區(qū)間】
1.試劑盒有效性判定：
（1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。
（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期。
2.標本結(jié)果判定：
（1）陽性：標本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。
（2）可疑：標本檢測結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時應對標本進行重復檢測，如重復實驗結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長期，則判定為陽性，否則為陰性。
（3）陰性：標本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值。
【檢驗結(jié)果的解釋】
通道及檢測結(jié)果 | 標本檢測結(jié)果解釋 |
FAM | |
陰性（－） | 標本中未檢出牛傳染性胸膜肺炎 |
陽性（＋） | 標本中檢測出牛傳染性胸膜肺炎 |
【檢驗方法的局限性】
- 當檢測樣本中被檢核酸濃度含量低于本試劑盒的低檢出*可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果。
- 本試劑盒僅供標本初步篩查使用，對于本試劑盒檢測陽性結(jié)果應進一步使用培養(yǎng)法進行確診。
【產(chǎn)品性能指標】 產(chǎn)品的低檢出限為102CFU，產(chǎn)品CV值≤5%。
【注意事項】
- 整個檢測過程應嚴格按照本說明書要求分別在試劑準備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR擴增區(qū)進行操作，各區(qū)實驗服、儀器、耗材應獨立使用，不能混用；實驗用吸頭采用帶濾芯吸頭；樣本處理區(qū)應配有生物安全柜，樣本處理在生物安全柜中進行操作；三個區(qū)應該配有紫外線殺菌裝置。
- 每次實驗應該設置陰、陽性對照。
- 為保證試劑不受標本污染，必須將DNA提取液、混合酶液及PCR反應液保存于試劑準備區(qū)。
- 試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻，并應瞬時離心。
- 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在di一次使用前應全部轉(zhuǎn)移至標本準備區(qū)，并單獨存放。
- 為防止熒光干擾，應避免裸手直接接觸PCR反應管，并應避免在PCR反應管上進行任何標記。
- 儀器擴增相關參數(shù)應按照本說明書相關要求進行設置；不同批號試劑不能混用。
- ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設置中不選ROX校正，淬滅基因選擇None。
- 實驗過程中產(chǎn)品的廢棄物應該進行無害化處理后方可丟棄。
